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任何膜蛋白，包括受体、离子通道和转运体，都由多个亚基组成，并可形成寡聚物。辅助性亚基也可以与这些复合体相关联，并影响它们的整体结构、功能和定位。一个主要的挑战是在自然条件下研究这些膜复合物，而不破坏它们的环境，因为它们与脂质和相关蛋白质的相互作用可能对它们的组装和功能至关重要。只有少数几种方法能够验证天然膜蛋白复合物，而且通常困难且耗时。它们通常依赖于组织处理、膜组分制备、增溶或质谱分析，有时还需要化学交联。较好的替代方法是依赖光学检测的邻近相互作用分析，但其中一些缺乏空间分辨率，很难排除蛋白质不直接相互作用的可能性。华中科技大学生命科学与技术学院的刘剑峰教授课题组、法国功能基因研究所的J-PPin和PhilippeRondard教授开发了一种从分离的组织中测定内源性细胞表面蛋白复合物亚基组成的方法，它依赖于基于纳米体的传感器，可以在时间分辨荧光共振能量转移(FRET)测量中实现亚基之间的近距离检测，揭示了功能性代谢型谷氨酸(mGlu)2-mGlu4异源二聚体以及mGlu2和mGlu4同源二聚体的存在。总之，这些多功能的生物传感器可以高保真、方便地确定天然组织中内源性膜蛋白的存在和活性。该工作以“Nanobody-basedsensorsrevealahighproportionofmGluheterodimersinthebrain”为题，发表在《NatureChemicalBiology》上。mGlu受体是G蛋白偶联受体，由调节许多突触活动的神经递质谷氨酸激活，是用于神经和精神疾病的药物的治疗靶点。目前已经鉴定出8个编码mGlu受体的基因，表达的mGlu1-mGlu8受体是强制性的同源二聚体，两个亚基通过二硫键连接。之前的结构研究证实了细胞外谷氨酸结合结构域(ECDs)具有特定的对称构象，两个结构域都是封闭的，具有特定的活性取向，而七跨膜结构域受体(7TM)的二聚体是不对称的，只有一个结构域能够激活G蛋白。在重组细胞中观察到的16种可能的mGlu异源二聚体中，mGlu2-mGlu4异源二聚体是研究最多的，但其在大脑中的存在和丰度尚不清楚。为了明确不同大脑区域的这一问题，作者开发了两种基于纳米体的TR-FRET传感器(图1)：(1)构象传感器或“生物传感器”，揭示了这些受体在激动剂结合时的激活，(2)“检测器”，使mGlu同源二聚体和异源二聚体的相对定量成为可能。

图1

首先作者开发的是基于FRET的mGlu2构象生物传感器。作者利用mGlu2受体DN10和DN1的一对特异性和高亲和力的纳米体，开发了mGlu2同源二聚体的“生物传感器”。DN10在活性状态下特异性识别受体二聚体，而DN1对构象状态不敏感(图2a)。该传感器由7.5nM的供体纳米体DN1-Tb(粉色)(Lumi4-Tb为圈出的“D”)和15nM的受体纳米体DN10-d2(紫色)(d2为圈出的“a”)制成，通过FRET信号可观察到激动剂(ago)或拮抗剂(antago)存在下的活性和非活性状态。

图2

接下来，作者使用DN1-Tb和DN1-d2作为TR-FRET对，首先在转染的细胞表面量化mGlu2同源二聚体(图3a)。正如预期的那样，这种“检测器”信号与同源二聚体的构象无关，无论是与激动剂还是拮抗剂结合(图3b)。在所有mGlu同源二聚体中，这个“检测器”也特异于mGlu2(图3c)，即FRET信号主要是由mGlu2引起的，从而通过FRET信号与浓度之间的曲线关系进行定量。类似地，作者通过改变TR-FRET对进一步对mGlu4同源二聚体和mGlu2–mGlu4异源二聚体进行定量。

图3

最后在小脑外的大部分大脑区域，作者使用mGlu2-mGlu4“检测器”比使用mGlu4同源二聚体“检测器”检测到的信号更高。这种信号强度的差异不是由于在每种二聚体组合中纳米体之间的FRET效能差异造成的。mGlu4同源二聚体DN42“检测器”或mGlu2-mGlu4异源二聚体DN1-DN42“检测器”获得的FRET与SNAP或CLIP亚基的细胞表面表达之间的相关性最好地说明了这一点(图4a)。这些数据表明，在小脑外的大部分区域，mGlu2-mGlu4异源二聚体比mGlu4同源二聚体多(图4b)。

图4

总之，该研究描述了一种创新和通用的方法，结合了TR-FRET技术的高空间分辨率，使用基于纳米体的光学传感器来定量和分析内源性多亚基膜蛋白。利用这种方法，作者提供了mGlu2-mGlu4异源二聚体在不同脑区存在的直接证据。结果显示，在小脑以外的大部分大脑区域，大多数mGlu4亚基可能与另一个亚基(如mGlu2)有关。同时该方法是通用的，因为荧光团可以共价连接到小配体，抗体片段或普通抗体。

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